免疫熒光單標記和雙標記的方法

1. 免疫熒光單標記方法

免疫 熒光單標記是指只標記一種蛋白質分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結果。具體染色方法如下。

1)所需材料與試劑

(1)培養在蓋玻片或玻璃培養皿中融合程度達到60％一70％的細胞。

(2)一抗、FITC或TRITC標記的二抗。

(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃預冷20min)。

(4)封閉液。

(5)0．01mol／LPBS緩沖液。

2)染色方法

(1)取出培養有細胞的蓋玻片或glass―bottom培養皿，用0.01MPBS洗2―3遍

(2)加入0.3％的TritonX―100，37℃，30rain。

(3)加入4％多聚甲醛室溫固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

(4)正常阻斷血清1：20封閉室溫20～30min，抑制IgG的非特異性結合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃過夜?？贵w以0.01mol／LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經試驗而定)。

(6)0.3％TritonX―100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0.3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。

 (7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗，37℃，孵育1h。

(8)0.3％TritonX―100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用濾紙吸干。

 (9)90％甘油(PBS配制)封片。

(10)激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

 2．免疫熒光雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子，當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊，且盡量遠離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。

3，樣品制備注意事項

(1)在進行免疫熒光標記時，如樣品的來源為組織，應采用冷凍切片。

(2)樣品制備應滿足一般熒光顯微鏡觀察的要求

(3)盡量去除非特異性熒光信號。細胞經熒光染色后可能會產生自發熒光，可用PBS取代一抗作為對照，以區分自發熒光和陽性結果。

 (4)為了不將細胞壓扁，蓋玻片與載玻片之間的介質多用甘油與PBS混合液(9：1)封片，甘油還有抗熒光淬滅的作用。同時還應注意封片時避免產生氣泡。

 (5)用指甲油將蓋玻片四周封片，注意避免將細胞壓扁。

 (6)為防止熒光淬滅，可在介質中加入抗氧化劑DABCO(100mg／mi)，室溫，密封可保存6個月；或苯二胺(100mg／mi)，-20℃，保存2～3周。

蘇州千舍熱賣熒光標記細胞：

 人肺癌細胞熒光素酶標記 A549+luc

 人膽囊癌細胞熒光素酶標記 GBC-SD+LUC

人永生化表皮細胞熒光素酶標記 HACAT+LUC

人非小細胞肺癌細胞熒光素酶標記 HCC827+LUC

人結腸癌細胞熒光素酶標記 HCT116+LUC

人宮頸癌細胞熒光素酶標記 HELA+LUC  

人胃癌細胞黃色熒光標記 HGC-27+YFP

人結直腸癌細胞熒光素酶標記 LOVO+LUC

人乳腺癌細胞熒光素酶標記 MCF-7+luc

人乳腺癌細胞熒光素酶標記 MDA-MB-231+LUC

人高轉移性肝癌細胞熒光素酶標記 MHCC-97H+luc

人胃癌細胞熒光素酶標記 NCI-N87+LUC

人皮膚黑色素瘤細胞熒光素酶標記 SK-MEL-2+LUC

人卵巢癌細胞熒光素酶標記 SK-OV-3+LUC

人類星形膠質瘤耐替莫唑胺細胞熒光素酶標記 U251 MG/TMZ+LUC(3000)

人乳腺癌細胞熒光素酶標記 ZR-75-1+luc

小鼠乳腺癌細胞熒光素酶標記 4T1+luc

小鼠黑色素瘤細胞熒光素酶標記 B16-F10+LUC

小鼠結腸癌細胞熒光素酶標記 CT26+LUC

小鼠膠質細胞瘤熒光素酶標記 GL-261+luc

小鼠肝癌細胞熒光素酶標記 HEPA1-6+LUC

小鼠卵巢上皮癌細胞熒光素酶標記 ID8+LUC

小鼠骨肉瘤成骨細胞熒光素酶標記 K7M2WT(K7M2-WT)-LUC

小鼠肺癌細胞熒光素酶標記 LLC+LUC

小鼠結腸癌細胞熒光素酶標記 MC38+LUC

   小鼠腦神經瘤細胞熒光素酶標記 neuro